細胞懸浮培養技術在獸用疫苗領域的應用

 1 懸浮培養技術在生物制藥中的應用歷史和現狀

1962年，Capstick等對BHK21細胞馴化實現懸浮培養，并用于獸用疫苗生產。1967年，Van Wezel又開發了微載體并實現在生物反應器中大規模培養貼壁細胞。到20世紀80年代，CHO細胞實現懸浮培養，治療性抗體生產技術的發展極大地推動著生物反應器在生物制藥行業中的應用，到20世紀末已進入萬升級規模。

2000年以后，隨著流加培養、灌注培養、個性化細胞培養基等技術的發展，作為大規模培養主要設備的生物反應器規模也趨向大型化和簡單化。現在，10000L及以上體積的反應器達一百多臺，zui大已達25000L，且幾乎都是可以放大的機械攪拌式反應器，主要為Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有。2007年銷售額zui高的6大類生物技術藥物中，有5類是經哺乳動物細胞表達生產的。縱觀國內，人用和獸用疫苗生產企業已超過110家，應用反應器懸浮培養技術生產疫苗的僅4家。一般獸用疫苗企業采用國內自主開發的650 L和1200 L反應器生產口蹄疫疫苗。

2懸浮培養工藝中的關鍵技術

懸浮培養技術主要包括高表達細胞株的獲得、個性化培養基的研發、動物細胞反應器及配套設施的完善及生產工藝的優化等四個方面。

2.1 細胞與毒株的馴化

為提高生物制品的產率和安全有效性，在生物反應器中繁殖的病毒與細胞需要進行相互適應選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對于細胞大規模生產具有重要意義。

為實現馴化的穩定，通常由高密度細胞培養轉向低密度細胞培養，由高濃度血清培養逐漸降低血清濃度進行培養。細胞馴化時應該注意保持細胞活力應90%以上，測定細胞增殖能力的和表達分泌能力進行，避免馴化后的細胞表達特性發生變化。馴化后細胞的增殖能力、活力及生產能力要能夠滿足工業大規模生產的需要。由于特定細胞的營養需求不同，實現其馴化的難易程度也不同，在馴化時需要選用合適的細胞培養基，有針對性地補充某些營養成分以滿足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無血清生長的特性。

2.2 細胞培養基的個性化

在大規模培養技術中，維持細胞高密度甚至無血清生長，細胞培養基的營養含量對細胞的增殖、維持至關重要。在懸浮培養技術中，不同細胞營養代謝的特異性不同，細胞和病毒培養工藝不同，需要抗剪切力、滿足放大功能，還需要提高目標生物制品的穩定性、表達量，這些均需要個性化培養基的支持。我國銷售的細胞培養基卻多為20世紀50年代發明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細胞培養基等，這些目錄產品難以滿足生物反應器大規模培養動物細胞的技術要求，直接影響了生物制藥行業技術升級。從對人類和動物安全性的長遠考慮，生物制品生產越來越傾向采用無血清無動物組分培養基，因為無血清培養基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產品易于純化、回收率高，上生物制藥生產中，已經有50%以上采用無血清細胞培養基。

2.3 細胞培養工藝的研發

懸浮培養過程技術的開發和應用主要是生產工藝的開發和工藝過程優化，維持細胞生長和病毒繁殖的*化環境控制，在懸浮培養技術中的作用同樣至關重要。

2.3.1懸浮培養和微載體培養

懸浮培養技術按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養和貼壁細胞微載體懸浮培養。懸浮細胞可以在反應器中直接生產增殖，細胞自由生長、培養環境均一、取樣簡單、培養操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細胞在反應器中懸浮培養需要借助微載體，細胞和球體接觸部位營養環境較差，培養、取樣觀察及放大工藝復雜，成本高。

雖然相對于懸浮培養，微載體培養復雜，但與轉瓶培養相比仍有很大優勢，能提高生產規模、產品質量和勞動效率，因此是貼壁細胞懸浮培養的主要手段。常見的微載體有實體的Cytodex微載體、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時細胞貼附于載體內部生長，表面細胞較少，難以使用細胞消化等方法將載體和細胞進行分離，且反應器放大工藝困難，不適合非釋放病毒的培養。而Cytodex比較適應罐倒罐的反應器放大工藝，目前報道的貼壁細胞生產工藝的*形式是機械攪拌式反應器實體微載體懸浮培養系統，可實現zui有效的優化工藝和zui適宜的工藝設計，其*工藝設計體現于高密度連續灌流培養。

2.3.2懸浮培養方式

選擇反應器懸浮培養方式需要考慮細胞和病毒的關系、產物穩定性、細胞培養基或添加物的選擇、細胞培養規模等幾個因素。按照培養方式分為批培養、流加培養及灌注培養。

批培養能直觀反映細胞在生物反應器中的生長、代謝變化，操作簡單，但初期代謝廢產物較多，抑制細胞生長，細胞生長密度不高;流加培養操作簡單、產率高、容易放大，應用廣泛，但需要進行流加培養基的設計;灌注培養的培養體積小，回收體積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，利于保持產品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養基利用效率低、旋轉過濾器容易堵塞等。不同的病毒采用的培養方式不同，如對于分泌型且產品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養，且灌注培養也更適宜于微載體培養。

同一生物制品由于其營養環境的不同，其生產工藝也可能發生變化，如BHK21細胞生產口蹄疫病毒，低血清培養時采用批培養，接毒前需要更換無血清的維持液;而無血清培養過程中無需換液，配合流加培養可能效果更好。

3 細胞懸浮培養在畜禽疫苗中的應用

目前疫苗免疫是控制動物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質量，降低疫苗成本已成為各大動物疫苗生產企業關注的焦點。工業化細胞培養生產疫苗是提高疫苗質量，降低成本的有效手段。

3. 1 豬病毒病疫苗

狂犬病毒在2 L的生物反應器繁殖，病毒zui大滴度能夠達到1.38×108pfu/ mL，且生產的疫苗質量達到WHO要求。無血清微載體細胞培養有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產。同樣有不少關于細胞培養大規模生產豬偽狂犬、豬藍耳病、豬口蹄疫、豬瘟、豬細小病毒病等疾病疫苗的報道。

3. 2 禽病毒病疫苗

禽類疫苗主要通過SPF雞胚生產，但雞胚生產疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產周期長，易污染，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個病毒毒株。因此，SPF雞胚生產疫苗的效率很低。我國已經能夠通過細胞培養生產出符合《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》的雞傳支H120細胞弱毒苗。楊濤等也報道了禽流感病毒在MDCK細胞中大規模增殖規律。國外有不少關于細胞培養生產禽馬立克病毒、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎、產蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報道。

4 展望

應該認識到，快速實現懸浮培養技術在疫苗生產中的應用只是搭建了一個升級工藝的平臺，而不是zui終目的，行業和企業發展真正的動力是新獸藥、新疫苗、新工藝以及配套技術的創新。

例如無血清培養基的開發和無血清培養病毒生產技術的開發;利用合適的培養基和轉染或馴化技術實現貼壁細胞的懸浮培養構建;新宿主細胞表達品種開發，例如同一種產品采用新的宿主細胞表達或是開發一種表達的宿主細胞適應幾種產品的表達等。總而言之，整合行業li量，快速實現懸浮培養技術在疫苗生產中的升級換代是未來幾年我國生物制藥行業發展的重點。這個過程應重視成熟技術、成功率，減少和避免時間、資金、人力等資源的浪費，減少機會成本，搶占市場先機。

懸浮培養技術的升級將導致行業整合與重組，生物制藥行業將出現明顯的集約化趨勢，有實力的企業將不斷以創新新藥、新技術研發為基礎和核心競爭力，同時借助資金實力整合制造和營銷體系，成為真正意義上的。