從北京到世界: CHO細胞的“中國往事”

 2018-03-26  細胞摩天輪  上海蒂科生物科技有限公司   

*，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是生產蛋白類藥物的宿主細胞，因為與其他系統相比，CHO細胞具有以下優點：①CHO 細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能，因此其表達的蛋白質的生物學活性更接近于天然蛋白；②CHO細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強，可根據培養要求選擇可貼壁培養或懸浮培養的方式；③整合外源基因后的細胞穩定，重組基因能擴增和表達；④表達的目的蛋白可由細胞內運輸到細胞外，并且CHO細胞只表達少量的內源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市場上一半以上zui為的生物制劑是由CHO細胞產生的。如，阿達木單抗（Humira）、貝伐單抗（Avastin）和利妥昔單抗（Rituxan）。可以說，CHO細胞對現代生物藥工業發展做出了不可磨滅的貢獻。不過你是否知道CHO細胞zui早的歷史？今天，讓我們簡單梳理一下CHO細胞的前世今生，了解一下CHO細胞背后的故事，或許可以給我們未來的工作更多啟發和思考。

中國倉鼠（學名 Cricetulus griseus）屬于來自于中國北部和蒙古地區的嚙齒動物家族。1919年，北京協和醫學院的胡正祥教授（注：胡正祥，1896年生，病理學家。1921年畢業于美國哈佛醫學院，后在美國麻省總醫院繼續學習病理學5年。回國后歷任北京協和醫學院副院長，病理系教授、系主任等職，在病理學研究中頗有建樹。）zui早在北京使用中國地倉鼠研究肺炎球菌，由于條件所限，試驗小白鼠很難獲得，正好北京周圍的中國地倉鼠眾多，中國地倉鼠便成為了很好的試驗研究工具。后來在北京協和醫學院工作的美國科學家Jocelyn Smyly和Charles Young發現中國地倉鼠很容易感染寄生蟲利什曼原蟲從而引發Black fever黑熱病，之后中國的醫學科研人員都使用中國地倉鼠來研究各種傳染性疾病，中國倉鼠成為了流行病學研究的有力工具。

1948年12月，南京解放前的一個黑暗的深夜，美國洛克菲勒基金會醫療部（Rockefeller Foundation’s International Health Division）醫生Dr. Robert Briggs Watson冒著生命危險，帶著一箱20個北京胡正祥教授贈與的、用來繼續研究在亞洲肆虐的瘧疾的中國地倉鼠，躲過交戰區，驅車到上海機場。盡管寒冷的雨滴強烈拍打著玻璃，泥石流隨時可以阻斷道路，zui終Watson還是成功地登上了Pan Am航班離開了中國，將這批中國地倉鼠運給紐約的試驗動物專家Victor Schwentker。誰也沒有想到，很多年后，伴隨他的20只中國地倉鼠，會成為當代藥物生產工業的關鍵“鑰匙”。 

美國科學家后來完成了中國地倉鼠的繁育，使其成為科學研究的有力工具。University of Colorado Medical Center的Dr.Theodore T. Puck和他的下屬同事Fa-Ten Kao在1957年從波士頓癌癥研究中心的Georege Yerganian博士的實驗室獲得了一個雌性中國地倉鼠，并成功分離了CHO細胞株，由于該細胞快速懸浮生長和高蛋白表達的特性，CHO細胞開始在科研和企業獲得普遍的應用。 

1984年，Genentech公司實現重組中國倉鼠卵巢細胞表達組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)并于1987年成功獲批上市，標志著哺乳動物細胞表達系統生產蛋白藥物的一個標志性事件。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動物細胞，一些有價值的蛋白不斷實現表達，包括凝血因子、促紅細胞生成素(EPO)、免疫球蛋白、尿激酶、乙肝表面抗原（HBsAg）和單克隆抗體等，極大地促進了生物藥工業的發展。同時，隨著CHO細胞在實驗室的普及，科學家成功分離出的不同亞型的CHO細胞株，比如CHO-S, , CHO DXB11, CHO DG44， CHO-M以及近年來受到持續關注的GS基因敲除的CHO細胞（如Merck/Sigma Aldrich公司的CHOZN, Lonza的CHO GS Xceed, Horizon公司用rAAV技術敲除的CHO細胞）。

不過遺憾的是，由于當時特殊的歷史背景，Robert Watson后來被中國細菌戰委員會指控為戰爭罪犯，這也間接導致了協和醫學院胡正祥教授的入獄，胡教授后來被作為“反動學術”遭批斗po hai，1966年，胡正祥夫婦先后在家中zi sha。如今在和平年代，撫今追昔，我們緬懷為人類健康事業做出巨大貢獻的老一輩科學家們，也更加珍惜來之不易的一切。

另一方面，伴隨著CHO細胞應用的普及，CHO細胞培養基產業也得到了充分的研究和快速的發展。傳統上CHO細胞的培養是在DMEM/F12基礎培養基中添加5-10%的胎牛血清完成的，血清除了供給細胞的營養成分外，還提供了題為培養細胞增殖所必須的生長因子，但血清的使用存在批次間差異大，易被支原體和病毒等污染，成本高，不利用產品分離純化等很多弊端，以及影響細胞的生長及zui終產物的質量，不適于大規模工業化生產。所以從70年開始科學家就開始研究和開發工業無血清培養基。無血清培養基的開發大大提高了CHO細胞培養工藝的便利性，可重復性以及降低了產品純化壓力。經過幾十年的發展，動物細胞無血清培養基經歷了動物蛋白水解物培養基，植物蛋白水解物培養基到無血清化學成分限定的培養基等幾個階段。典型的無血清培養基含有50-70中成分，包括氨基酸，維生素，微量元素，生長因子，無機鹽，緩沖體系等。向培養基中添加動物或植物的蛋白水解物可以有效地提高細胞生長密度，延長細胞活性，從而提高抗體表達量，常見的有大豆、酵母和小麥蛋白水解物等，但是由于其成分的復雜性和批次間的質量差異，添加蛋白水解物可能會造成培養基批次間不穩定從而影響培養過程和產品質量。所以，目前及未來無血清培養基的趨勢是采用無動物源、化學成分確定的配方進行生物制藥生產。

由于在研發實力、質量體系、生產控制和品牌影響力等方面的優勢，外企培養基公司占據了細胞培養基市場的絕大部分份額，目前國外的CHO細胞培養基公司有HAKATA（Now part of Therm Fisher）, SAFC(Now part of Merck),  Hyclone(Now part of GE Healthcare), Irvine Scientific（A member of JXTG Group）,  Lonza等，支撐了上市的眾多生物藥的商業化生產。同時，不同供應商也在努力提高培養基研發和生產的技術能力，基于不同的細胞培養應用，不斷更新升級換代培養基的配方和配置方法。比如Thermo Fisher/HAKATA通過的AGT技術，使干粉培養基的配置過程變得便捷、簡單。Merck/SAFC去年宣布上市了*個商業化的用于灌注工藝培養的培養基，來應對灌注培養工藝的挑戰，美國Irvine Scientific公司也新推出了用于GMP-ready 的CHO細胞灌注培養基及用于Fed-batch培養的濃縮的補料BalanCD CHO Feed 4，并且Feed 4干粉配置過程同樣簡單，加水溶解，無需調節pH，便捷的配置方案對生物藥工業大規模生產具有很大的吸引力。

生物醫藥行業是中國戰略性新興產業，國內生物制藥行業經過多年的發展，目前也有一批本土公司專注于開發無血清培養基和優化細胞培養工藝，也取得了可喜的進展。由于不同細胞株的代謝需求不*一樣，所以很難開發出一款能夠滿足所有細胞應用需求的“通用型”CHO細胞培養基，同時為了大規模生產階段成本和工藝和風險控制的考慮，很多公司還是會選擇在項目進展到一定程度后開發個性化定制培養基，未來培養基的大規模生產技術 – 能否保證大規模培養基干粉的質量和批次穩定性，也將成為培養基公司的核心競爭力之一。 

總之，CHO細胞的出現給整個生物制藥產業注入了無窮的活力，產生了巨大的科研和經濟價值，并將一直造福人類，同時，使用CHO細胞平臺表達生物藥還面臨這一些挑戰，需要學術和工業界一起努力，從綜合利用科學和工程的知識來解決，比如

①構建的重組CHO細胞生產效率低，產物濃度亦低，培養工藝復雜，而且CHO細胞株的穩定性還較差；

②某些糖基化表達產物不穩定，不易純化； 

③重組CHO細胞上游構建與下游分離純化脫節，主要表現在上游構建時著重考慮它的表達，而對高表達的產物的分離純化過程考慮較少； 

④重組細胞培養費用昂貴，自動化水平低下。 

隨著技術的發展和我國對生物藥產業投資支持力度的加大，我們也衷心希望，有朝一日我們能誕生真正屬于我們自己知識產權的“CHO細胞”及相關創新產品，更好地迎接我們生物制藥產業的新時代。