流式細胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術(shù)。流式細胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。

一、基本結(jié)構(gòu)
流式細胞儀由三部分構(gòu)成
1.液流系統(tǒng)，包括流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng);
2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng);
3.電子系統(tǒng)，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。流式細胞儀的I作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè)向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經(jīng)計算機處理形成相應(yīng)的點圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進行分析。用于FCM的樣本是單細胞懸液，可以是血液、懸浮細胞培養(yǎng)液、各種體液、新鮮實體瘤的單細胞懸液以及石蠟包埋組織的單細胞懸液等。

二、流式細胞術(shù)的基本操作與技巧
1）細胞的制備、培養(yǎng)
2）封閉
3）熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記
4）光電倍增管電壓的設(shè)定
5）對照的設(shè)置
6）補償調(diào)節(jié)

以體外培養(yǎng)的PBMC細胞為例：
1、細胞培養(yǎng)在96孔板中，直接收集細胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；
2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；
3、封閉：標(biāo)記樣品細胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成，即包含有特異性結(jié)合抗原位點的Fab段和相對保守的Fc段，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時利用Fab段的抗原結(jié)合位點與細胞上抗原分子特異性結(jié)合，從而標(biāo)記并且相對量化細胞表達該抗原分子的情況。但是，有些細胞表面表達FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細胞、DC、B淋巴細胞等， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進行非特異性的結(jié)合，對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

封閉方法1： 取適量的血清全IgG抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。研究人的細胞時，若熒光素偶聯(lián)抗體來源于小鼠，封閉采用小鼠血清全IgG抗體。原則是，如果流式抗體可能與樣品細胞的FcR發(fā)生非特異性結(jié)合，那么在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前先用流式抗體同源的全IgG抗體進行封閉，使樣品細胞表面的FcR飽和。

封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力較強；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力中等。而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體，所以在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細胞，使樣品細胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結(jié)合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結(jié)合。

4、標(biāo)記相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達量相對較高，1μl足夠了，假如有9個樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機分析。

6、電壓的設(shè)定：上機分析時，確認機器沒有問題后，首先就是調(diào)節(jié)每個通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區(qū)分細胞群，假如我們想研究人的淋巴細胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細胞、單核細胞還有中性粒細胞等，那我們怎么把它們分開呢？這時候就要用到我們前面提過的FSC和SSC，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細胞亞群，原則就是使樣品細胞或者目標(biāo)細胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細胞的時候多鋪一個孔，染色時將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調(diào)節(jié)），原則就是使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離。

三、注意事項

（1）在細胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

（2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官，主要由免疫細胞組成，制成單細胞懸液，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可。

（3）如果是實體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織，實體臟器細胞之間一般結(jié)合緊密，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細胞懸液。因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實體臟器研磨后的單細胞懸液以實體細胞為主，如果研究目標(biāo)不是實體細胞，而是臟器內(nèi)浸潤的免疫細胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細胞，然后再進行流式分析。

（4）調(diào)節(jié)電壓時，如果檢測的目標(biāo)細胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細胞與細胞碎片在流式圖中能夠*分離；如果檢測的目標(biāo)細胞體積較大，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細胞群完整顯示于流式圖中，防止細胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者*處于邊界外。

（5）關(guān)于樣本的封閉，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標(biāo)記人的細胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來源于小鼠，人細胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合，但是，也有可能因為種屬關(guān)系較近，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合，實驗者很難判斷實驗過程中這種結(jié)合是否會發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結(jié)合一定不會發(fā)生。所以，條件允許的話，實驗者最好養(yǎng)成封閉樣品的習(xí)慣。