★CQ★細胞培養-消化要有個度

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★CQ★細胞培養，尤其是細胞系的培養，就細胞消化而言，多做、善于總結，就可以把細胞養的越來越好。

★CQ★絕大部分細胞消化只要用胰酶潤洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細胞全部消化成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經可以了。

一般能移動了，說明細胞與培養基質材料的附著已經消失了，細胞之間的附著也已經消失了，細胞已經獨立分布了（雖然沒有呈現很廣的離散分布）。這個時候應該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細胞就是*成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性，你可以嘗試，準備100%的單個細胞懸液，貼壁后觀察細胞，仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。

一些懸浮培養細胞也是如此，容易聚集，不要過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液。細胞只要能從基質上脫離下來，即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次（一般10次即可），成小規模聚集（10個細胞左右）是正常的，不要再去延長消化時間，等待單細胞懸液出現。

★CQ★比較難消化的細胞：

潤洗方法5min還不能消化，以結腸癌細胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細胞，胰酶消化，一般10 cm 培養皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細胞，一般不超過5min，即可見細胞成片移動，就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候，比如tsDC細胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

★CQ★常規的細胞實驗，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細胞例外）。但少數實驗，比如病毒包裝，對細胞代數，對細胞狀態要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數一多，細胞包裝能力就會逐漸下降。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響細胞外基質相關酶的活性，來使得細胞脫離基質附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯合作用。這里要明白，胰酶切割細胞外基質的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于整聯蛋白的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不*的話），而應該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為血清中含有抑制胰酶的蛋白。對于一些難消化細胞，可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。但對于絕大部分細胞用胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液。

每段時間定期對細胞房、培養箱&水盤、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個角落細菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發現污染，及時處理。