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1、 血清的主要成分和功能

牛血清在細胞培養(yǎng)中對細胞的生長增殖具有重要甚至是難以替代的作用，它含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成分。主要有以下成分和功能：

A、 血清中的主要物質—蛋白質如白蛋白等具有緩沖細胞培養(yǎng)液酸堿度、維持滲透壓的作用。

B、 轉鐵蛋白、甲狀腺素結合蛋白等結合蛋白，有識別維生素、脂類、金屬和其它激素等，并能與有毒金屬和熱原質結合，從而起到解毒作用。

C、 纖維粘連素、胎牛血清中的胎球蛋白、貼壁因子等能促進細胞貼壁、鋪展。

D、 多肽類如血小板促生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子、胰島素、類胰島素生長因子、促生長激素等能支持細胞分裂增殖并維持細胞對數(shù)生長。

E、 2巨球蛋白等蛋白酶抑制劑能抑制蛋白酶，保護細胞不受損害。

F、 血清中還含有豐富的氨基酸、葡萄糖、酮酸及與蛋白相結合狀態(tài)的微量元素等，對細胞培養(yǎng)均有意義。

正因為血清具有如此復雜的成分和重要的功能，所以血清的保存和使用顯得非常重要。

2、 保存血清的方法：

我們建議血清應保存在-15℃至-20℃，有效期為5年，若存放于4℃時，請勿超過四周，若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀龋俜呕乩鋬觥２灰朔磸蛢鋈凇Ｅ渲瞥?培養(yǎng)基后應在四周內用完。

3、 血清解凍后有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后也會存在于血清中，也是造成沉淀物的主要原因之一，但這些絮狀沉淀物并不影響血清本身的質量，若您欲除去這些沉淀，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起過濾。我們不建議您以直接過濾的方式去除這些沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4、 如何解凍血清才不會使血清質量受損：

我們建議您將血清從冷藏箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融，但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

5、 為什么要熱滅活血清：

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦您使用熱滅活血清。

6、 有必要做熱滅活嗎：

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)細胞而言是不需要的，經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱滅活處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，類似于“小黑點”形狀，這常常會讓研究者誤認為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱滅活處理，如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時間，更確保血清的質量！

7、 如何避免沉淀物的產生：

我們建議您在使用血清的時候，注意下列操作：

A、 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20℃至37℃），實驗顯示非常容易產生沉淀物。

B、 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

C、 請勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得渾濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，從而影響血清質量。

D、 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可無須做此步驟，若必須做血清的熱滅活，請嚴格遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

ELISA檢測樣品的處理方法

通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的*步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。

1、  血清

血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。

用無熱原、無內毒素的試管或離心管采集血液標本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃GUOYE，使血清析出。（將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g離心20分鐘，仔細收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

采血過程中應避免溶血，因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質，在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導致檢測的不準確性。同時也應避免細菌污染，因為菌體內可能含有內源性的HRP從而導致檢測的假陽性。

2、  血漿

用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本，標本采集后30min內4℃ 1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。

常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

3、  細胞培養(yǎng)上清

取細胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細胞碎片及雜質，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

4、  細胞裂解液

1）  吸去培養(yǎng)板內的培養(yǎng)基，用胰酶消化細胞，加適量培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細胞可省略。

2）  收集細胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS潤洗3次。

3）  加入適量的預冷PBS或細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

4）  將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復凍融幾次，使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。

5）  4℃ 10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

5、組織勻漿液

1）  將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質。

2）  將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應盡量小，便于勻漿得更充分

3）  將組織按一定的比例加入預冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，檢測后計算樣品濃度時應乘以相應的稀釋倍數(shù)）

4）  吸取勻漿液到離心管，4℃ 5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

6、  尿液、唾液等其他液體生物樣本

1000×g離心20min，取上清即可檢測。

總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應離心去除。

為了保證檢測的準確性，保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個月內檢測；4℃保存的樣本應在1周內進行檢測。

另外，還應保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導致假陰性的結果。